Nat Biomed Eng︱叶玉如院士团队开发全脑基因编辑介导治疗阿尔茨海默症的新策略

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撰文︱景琦琦

责编︱王思珍

不认识任何人，不理解任何事，如处在一个异次元空间一般，被无限的孤独包围着，这不是玄幻小说，这只是一个阿尔茨海默症晚期患者真实的一天。《百年孤独》的作者马尔克斯在其生命的后期罹患家族性阿尔茨海默症，正如同他的巨作所描述的一般—"百年孤独”。

阿尔茨海默症（Alzheimer's Disease，AD），俗称老年痴呆症，是一种最常见的神经退行性疾病，β-淀粉样蛋白（β-Amyloid，Aβ）过度累积和过度磷酸化tau蛋白形成的神经纤维缠结是AD的两个重要病理特征。AD分为散发性AD和家族性AD（fAD）。fAD仅占AD病例的3-5%。据估计，现在中国有超过50万名潜在的fAD患者【1】。

早老素1（presenilin 1，Psen1）和早老素2（Psen2）是γ-分泌酶的重要催化组成部分。γ-分泌酶（γ-secretase）切割Aβ前体蛋白（Aβ precursor protein，APP）从而产生Aβ（图1）。fAD主要由编码APP和Psen1/2的基因发生显性突变，继而导致Aβ的过度累积而产生【2】。尽管fAD有明确的遗传基因，而且可以在认知障碍发生之前进行诊断，但目前尚无针对 fAD 的有效治疗方法。 

图1 两种经典Aβ产生途径

（图片引自：Yixiu Zhou,et al., Cell Stress 2018; 2: 150-161）【3】

基因组编辑技术CRISPR/Cas9在作为治疗遗传突变引起的疾病（包括fAD）的策略方面具有巨大的潜力。特别是有助于在症状出现之前纠正致病基因突变，它被认为是一种"一劳永逸"的治疗，因为它的影响可以持续一生【4】。然而由于血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）的限制，CRISPR/Cas9仅对注射区域（如脑实质）产生一定的效果，极大地限制了治疗的效果【5】。因此，迫切需要一种能够在成人大脑中使用的高效、全局基因组编辑方法。

最近已开发出可穿过BBB的改良型腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）变体，可在静脉注射后在中枢神经系统中广泛转导【6】，有研究表明，由该AAV突变体传递的蛋白的过表达可恢复老年小鼠的缺血性卒中【7】。这些提示，该BBB可通过性病毒来修饰中枢神经系统中疾病相关基因的表达，有可能成为fAD等疾病的治疗策略。那么，这种突变病毒传递CRISPR/Cas9基因组编辑组分是否可以达到全脑治疗fAD的效果呢？

2021年7月26日，香港科技大学的叶玉如（Nancy Y. Ip）院士团队联合中国科学院深圳先进技术研究院、美国加州理工学院的科研人员共同在Nature Biomedical Engineering杂志在线发表了题为Brain-wide Cas9-mediated cleavage of a gene causing familial Alzheimer’s disease alleviates amyloid-related pathologies in mice的研究论文。研究人员成功开发了新型全脑基因编辑系统，并在成年活体AD小鼠上证明了其可长期有效缓解AD病理症状，为AD及其他神经退行性疾病的治疗提供了新的精准干预策略。

图2. CRISPR–Cas9介导的基因组编辑设计和验证，以破坏突变APP^swe等位基因

  （图片引自：Y Duan et al. Nat. Biomed. Eng 2021）

已知家族性APP^swe 基因中的两个突变位点，即K670N和M671L，使APP更容易被β-分泌酶剪切，从而产生更多的Aβ（图1）【2】。首先，研究人员以该突变型APP^swe为靶点设计sgRNA（SW1和SW2），并结合EGxxFP报告系统，从而成功构建了特异性靶向效率高并可有效消除突变型APP^swe的全新CRISPR-Cas9基因编辑系统（图2 a-c）。在fAD小鼠模型（5XFAD）海马中，通过9型AAV（AAV9）递送体系递送向导RNA（gRNA）和Cas9蛋白，证明了该系统能有效降低可溶性和不可溶性Aβ的水平、Aβ₄₀和Aβ₄₂的水平，即淀粉样斑块显著改善，并至少维持6个月（图2 d-f, 图3）；AD相关的病理特征也得到了改善，包括减少神经胶质细胞的激活和增生（图4）及神经元的丢失，从而改善神经功能。在另一种fAD小鼠模型（APP/PS1）中也得到了类似的结果。

图3. 海马内AAV介导的Cas9编辑降低5XFAD小鼠的淀粉样斑块负荷

（图片引自：Y Duan et al. Nat. Biomed. Eng 2021）

图4. 海马内AAV介导的Cas9编辑降低5XFAD小鼠的神经胶质细胞增生

（图片引自：Y Duan et al. Nat. Biomed. Eng 2021）

研究团队之后利用可跨BBB的AAV9突变体，即AAV-PHP.eB，开发全脑CRISPR-Cas9基因组编辑系统。通过静脉注射AAV-PHP.eB系统的方式向全脑递送gRNA和Cas9蛋白。实验显示，5XFAD小鼠单剂量静脉注射该AAV突变体-Cas9系统即可实现对突变型APP^swe基因的全脑基因编辑，并可在全脑范围减少Aβ斑块沉积，海马区域现象最为明显（图5），也可缓解Aβ相关病理，如小胶质细胞激活、神经轴突营养不良（图6 a-d）。通过旷场、Y-字迷宫以及高架行为学实验测试了治疗后小鼠的认知能力，研究结果显示：经注射AAV突变体-Cas9的5XFAD小鼠环境适应能力、工作记忆、认知能力都显著提高（图6 e-g）。

图5. AAV-PHPeB系统介导的Cas9-gRNA降低5XFAD小鼠的全脑内的淀粉样斑块负荷

（图片引自：Y Duan et al. Nat. Biomed. Eng 2021）

 图6. AAV-PHPeB系统介导的Cas9可减少5XFAD小鼠的小胶质细胞增生和神经突起营养不良，并改善其认知能力。

（图片引自：Y Duan et al. Nat. Biomed. Eng 2021）

同时，研究团队还发现，5XFAD转基因小鼠在接受基因编辑技术治疗的6个月后，即在小鼠平均寿命的三分之一阶段，其大脑中淀粉样蛋白斑块，仍然保持较低水平，减缓了AD病理进程，从而证明了该基因编辑技术的单次治疗可以维持长期疗效。 

文章结论与讨论，启发与展望

在这项研究中，研究人员首先通过向AD转基因小鼠模型海马区注射AAV-Cas9载体，证实其可在体内有效地编辑APP^swe等位基因，减轻转基因小鼠模型中Aβ沉积及其他相关病理特征。然后通过改进的可透过BBB的AAV突变体AAV-PHP. eB作为递送载体，在转基因小鼠中通过静脉注射CRISPR–Cas9系统，可在多个大脑区域实现有效的基因组编辑，并发挥有益作用，比如减少Aβ沉积、小胶质细胞增生、营养不良的神经轴突、以及改善认知功能。该方法为开发针对阿尔茨海默症，以及其他影响多个大脑区域的显性突变疾病的无创基因治疗提供了一种新方法。

虽然AAV-PHP. eB载体有望拓宽无创基因疗法，但其增加BBB通透性的功能并没有在非人灵长类动物中得到有效验证【8】，甚至不是所有的小鼠品系均可应用【9】, 对于改良腺病毒应用于全脑的基因治疗疗法依然任重而道远。同时, CRISPR/Cas9若想实现体内治疗，评估基因组基因编辑引起的潜在脱靶事件仍是亟待解决的问题。尽管，本文中，研究人员对单个小鼠内病毒转导的和未转导脑区的全基因组测序数据的比较表明，Cas9编辑引起的脱靶事件是罕见的，但其安全性仍需更加长期、全面的验证。然而，无论如何，这是一项令人振奋的研究进展，在基因编辑技术应用到遗传性脑疾病治疗领域是一个重要的里程碑，有助推动相关疾病的精准医疗发展。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-021-00759-0

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参考文献（上下滑动查看）  

【1】中国阿尔茨海默病患者诊疗现状调研报告, 2021

【2】Long J M. et al. Alzheimer Disease: An Update on Pathobiology and Treatment Strategies. Cell. 2, 179 (2019).

【3】Yixiu Zhou, Yuhui Sun, Quan-Hong Ma and Yaobo Liu Alzheimer’s disease: amyloid-based pathogenesis and potential therapies. Cell Stress 2 (2018).

【4】Ran, F. A. et al. Genome engineering using the CRISPR–Cas9 system. Nat. Protoc. 8, 2281–2308 (2013)

【5】Serrano-Pozo, A. et al. Neuropathological alterations in Alzheimer disease. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 1, a006189 (2011).

【6】Chan, K. Y. et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat. Neurosci. 20, 1172–1179 (2017).

【7】Zeng, J. et al. TRIM9-mediated resolution of neuroinflammation confers neuroprotection upon ischemic stroke in mice. Cell Rep. 27, 549–560.e6 (2019).

【8】Liguore, W. A. et al. AAV-PHP.B Administration Results in a Differential Pattern of CNS Biodistribution in Non-human Primates Compared with Mice. Mol. Ther. 27, 2018–2037 (2019).

【9】Matsuzaki, Y. et al. Intravenous administration of the adeno-associated virus-PHP.B capsid fails to upregulate transduction efficiency in the marmoset brain. Neurosci. Lett. 665, 182–188 (2018).

制版︱王思珍

本文完